REGULACIÓN DE LA
EXPRESIÓN GÉNICA EN SEMILLAS DE CEBADA Y ARABIDOPSIS.
GENE EXPRESSION REGULATION
IN SEEDS OF BARLEY AND ARABIDOPSIS.
Líneas de investigación
Las semillas de las plantas
son órganos muy especializados que durante la maduración acumulan en tejidos
tales como el endospermo en cebada y el embrión en Arabidopsis, gran cantidad
de sustancias de reserva y de proteínas de defensa, que servirán,
respectivamente, de nutrientes para el desarrollo de la nueva plántula en las
primeras etapas de la germinación y de protección frente a plagas. Algunos de
los genes implicados son específicos de endospermo, por ejemplo los que
codifican proteínas de reserva (hordeínas en cebada) y los de la familia
multigénica de inhibidores de proteasas y de α-amilasas heterólogas.
Nuestro objetivo es caracterizar los factores transcripcionales implicados en
la regulación de ambos tipos de genes, así como los implicados en la regulación
de genes de hidrolasas en aleurona post-germinación.
Por métodos bioinformáticos,
filogenómicos y por análisis funcional de los promotores, utilizando expresión
transitoria y métodos biolísticos (pistola de genes) en tejidos vegetales
(endospermo en desarrollo, hojas, aleurona), junto con ensayos de retardo en
geles (EMSA), hemos podido identificar motivos en cis capaces de interaccionar con factores transcripcionales tipo
bZIP (básico cremallera de leucinas), DOF (un solo dedo de Zn), MYB (R2R3
y R1) y B3 (FUS3, VIP/ABI3). Se han clonado y caracterizado a nivel
molecular varios cDNAs y clones genómicos, de estos tipos.
Seeds are specialized plant organs that during development accumulate in
its different tissues (endosperm in cereals, embryo in Arabidopsis) reserve
substances and defense proteins, that will be used as
nutrients for the development of the new plantule upon germination and as
protective agents against pests. Some of the genes involved are endosperm
specific, such are those encoding reserve proteins (hordeins in barley) and
those of the multigene family of inhibitors of heterologous proteinases and
α-amylases. Our main goal is to characterize the transcription factors
involved in the regulation of these genes, as well as those involved in
regulating hydrolase-encoding genes in aleurone upon germination.
Bioinformatic and phylogenomic searches and functional analysis of the
promoters by transient expression, by the biolistic (“gene gun”) approach in plant
tissues (developing endosperm, leaves, aleurone layers) together with
electrophoretic mobility shift assays (EMSA), have identified cis motifs putatively involved in
interactions with transcriptional factors of the bZIP class (basic leucine
zippers), DOF (DNA-binding with One Finger), MYB (R2R3
and R1) and B3 (FUS3, VIP/ABI3). We have cloned
and characterized at the molecular level several cDNAs and genomic clones of
these types.
Tecnologías
disponibles
-
Técnicas básicas
de biología molecular. Clonación de genes y expresión de proteínas en sistemas
heterólogos (E. coli). Mutagénesis
dirigida y proteínas recombinantes.
-
Reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). RT-PCR semi-cuantitativa y RT-qPCR..
-
Interacciones
proteína-proteína (sistema de 2 y 3 híbridos en levadura). Reconstitución de
proteínas fluorescentes (GFP; YFP; RFP).
-
Secuenciación
automática de DNA.
-
Unidad de transcriptómica:
micromatrices de DNA (microchips).
-
Métodos
bioinformáticos.
-
Transgénesis
vegetal: 1) método del plásmido Ti y 2) método biolístico (pistola de genes).
-
Microscopía
óptica: 1) inmunolocalización de proteínas y 2) técnicas de localización “in
situ” de mRNAs.
Tecnology available
-
Basic techniques in molecular biology. Gene cloning
and protein expression in heterologous systems (E. coli y P. pastoris).
Site-directed mutagenesis and recombinant proteins.
-
Polymerase chain reaction (PCR). Semi-quantitative RT-PCR
and Real Time quantitative PCR (RT-qPCR).
-
Protein-protein interactions: 1) 2 and 3 hybrid
systems in yeast and 2) reconstitution of fluorescent proteins in plant cells (GFP ; YFP ; RFP).
-
Automatic DNA sequencing.
-
Transcriptomic unit: DNA microarrays (microchips).
-
Bioinformatic
packages.
-
Plant transgenesis: 1) Ti plasmid method and 2)
biolistic procedure (gene gun).
-
Optical microscopy: 1) immunolocalization of proteins
and 2) in situ mRNA localization
techniques.
Aplicabilidad
de los resultados de investigación
Las investigaciones del
grupo inciden en aspectos básicos del proceso regulatorio en semillas de
cereales autógamos (cebada, trigo). Las empresas de semillas están más
interesadas en híbridos, como el maíz. Sin embargo, la empresa Crop Design
adquirió los derechos de patente del gen que codifica el factor transcripcional
BLZ2, específico de semilla.
-
Carbonero, P., Díaz, I., Vicente-Carbajosa, J., Lara, P. and Oñate, L.
1999. Nucleic acid molecule encoding transcription activity proteins. EP
Patent Application Cpnv./D1320EP.
Applicability
of research results
The research of our group is focused on basic aspects of the regulatory
process in autogamous cereal seeds (barley, wheat). The seed companies are more
interested in hybrid crops, such is maize. However, the company Crop Design
acquired from us the patent rights for the gene encoding the seed-specific
transcription factor BLZ2.
-
Carbonero, P., Díaz, I., Vicente-Carbajosa, J., Lara, P. and Oñate, L.
1999. Nucleic acid molecule encoding transcription activity proteins. EP
Patent Application Cpnv./D1320EP.
Colaboraciones
con otros grupos, instituciones y sector privado
-
En el pasado, hemos mantenido colaboraciones con los grupos del
profesor Indra Vasil (University of Florida, USA), profesor Robert J. Schmidt
(University of California, San Diego, USA) y con el profesor Karam Singh
(CSIRO, Perth, Australia) que se concretaron en publicaciones conjuntas y
visitas de los profesores americanos a nuestros laboratorios y visitas de los
profesores I. Díaz a la Universidad de Florida (6 meses), de J.
Vicente-Carbajosa a la Universidad de California (1 año) y L. Oñate-Sánchez
(Australia, 5 años).
-
La profesora P. Carbonero ha coordinado el programa de doctorado
conjunto en Biotecnología Agraria y Forestal entre la Universidad Politécnica
de Madrid y la Universidad de Chile, cuya última tesis doctoral (Dra.
-
Grupo de entomología agrícola (Director: Dr. Pedro Castañera) del
Centro de Investigaciones Biológicas
(CIB-CSIC, Madrid). “Respuesta de insectos fitófagos y de sus enemigos
naturales a inhibidores de proteasas de cebada (BTI-CMe; Hv-CPI) in
vitro y en plantas transgénicas” (2000-2005).
-
Profesor F. Javier Cejudo (Universidad de Sevilla). “Factores
transcripcionales en aleurona post-germinación y su regulación redox”
(2002-2005).
-
Numerosos grupos (más de 20) del consorcio europeo REGIA (Regulatory
Gene Initiative in Arabidopsis), sobre genómica funcional
de factores transcripcionales en esta planta modelo (2000-2003).
-
Dr. D. Weigel (Max Planck Institute, Tubingen, Alemania), G. Coupland
(Max Planck Institute, Colonia, Alemania), V. Colot y A. Lecharny (Unité de
Recherches en Génomique Végétale, Eury, Francia) y Dr. F.J. Paz-Ares (Centro
Nacional de Biotecnología-CSIC, Madrid) son los grupos con los que colaboramos en
el proyecto trilateral (España, Francia, Alemania) “REGULATORS” (2004-2007).
-
Dr. M. Caboche (INRA, Versailles, France) y Dr. H. Baumlein (IPG,
Gatersleben, Alemania) son los grupos con los que colaboramos en el proyecto
trilateral (España, Francia, Alemania) “ARABIDOSEED” (2004-2007).
-
Prof. W. Drögge-Laser de la Universidad de Götingen (Alemania) y el
Prof. X. Jordana de la Universidad Católica de Chile poseen sendas
colaboraciones con el Prof. J. Vicente-Carbajosa (2005-2008).
Collaborations with other groups, institutions and
private sector
-
In the past we have had
collaborations with the groups of Professor Indra Vasil (University of Florida,
USA), of professor Robert J. Schmidt (University of California, USA) and of
Professor Karam Singh (CSIRO, Perth, Australia) with the output of several
joint publications and visits of the American professors to our laboratories
and visits of I. Diaz to the University of Florida (6 mo.), J.
Vicente-Carbajosa the University of California (1 year) and L.
Oñate-Sanchez to Australia (5 years).
-
Professor P. Carbonero was
the coordinator of the Agricultural and Forestry Biotechnology PhD joint
programme between the Politechnical University of Madrid and the
-
Group of Agricultural
Entomology (Director: Dr. Pedro Castañera) from Centro de Investigaciones
Biológicas (
-
Professor F. Javier Cejudo (Universidad de Sevilla). “Transcription factors in post-germinating aleurone cells and their redox
regulation” (2002-2005).
-
Several groups (more than
20) from the European consortium REGIA (Regulatory Gene Initiative
in Arabidopsis), on functional Genomics f the transcription factors in
this model plant (2000-2003).
-
Dr. D. Weigel (Max Planck
Institute, Tubingen, Alemania), Dr. G. Coupland (Max Planck Institute, Colonia,
Alemania), Dr. V. Colot y Dr. A. Lecharny (Unité de Recherches en Génomique
Végétale, Eury, Francia) and Dr. F.J. Paz-Ares (Centro Nacional de
Biotecnología-CSIC, Madrid) are the groups with whom we collaborate in the
trilateral (Spain, Germany, France) project “REGULATORS” (2004-2007).
-
Dr. M. Caboche (INRA,
Versailles, France) y Dr. H. Baumlein (IPG, Gatersleben, Alemania) are the
groups with whom we collaborate in the trilateral (Spain, Germany, France) “ARABIDOSEED”
(2004-2007).
-
Prof. W. Drögge-Laser from
the
Publicaciones recientes /Recent publications
-
Diaz, I., Vicente-Carbajosa, J., Abraham, Z.,
-
Mena, M., Cejudo,
F-J., Isabel-La-Moneda, I., Carbonero P.
(2002). A
role for the
DOF transcription factor BPBF in the regulation of gibberelin-responsive genes
in barley aleurone. Plant Physiology 130: 111-119.
-
Carbonero P., Mena, M., Isabel-LaMoneda, I.,
-
Jakoby, M., Weisshar, B., Dröge-Laser,
Vicente-Carbajosa, V., Tiedemann, J. and Parcy, F. (2002). bZIP
transcription factors in Arabidopsis. Trends Plant Sci. 7: 106-111.
-
Alfonso-Rubí J., Ortego F., Castañera P. , Carbonero
P., Díaz, I. (2003). Transgenic expression of trypsin inhibitor CMe from barley
in indica and japonica rice, confers resistance to the rice weevil Sitophilus oryzae. Transgenic Research 12: 23-31.
-
Martinez M.,
Rubio-Somoza, I., Carbonero P., Díaz, I. (2003). A cathepsin B-like cysteine
protease gene from H. vulgare (gene CatB) induced by GA in aleurone
cells is under circadian control in leaves.
Journal of Experimental Botany
54: 951-959.
-
Isabel-LaMoneda,
I., Díaz, I., Martinez M., Mena, M.,
Carbonero P. (2003). SAD: a new DOF protein from barley that activates
transcription of a cathepsin B-like thiol protease gene in the aleurone of
germinating seeds. The Plant Journal 33: 329-340.
-
Lara, P.,
Oñate-Sanchez, L., Ferrándiz, C., Abraham, Z. Díaz, I., Carbonero P.,
Vicente-Carbajosa, J. (2003). Synergistic activation of seed-storage protein gene
expression in Arabidopsis by AB13 and two bZIPs related to Opaque-2. Journal of Biological Chemistry 278: 21003-21011.
-
Diaz, I.,
Vicente-Carbajosa, J., Abraham, Z.,
Martinez M., Isabel-LaMoneda, I., Carbonero P. (2003). GAMYB and BPBF
transcriptional factors in the control of gene expression during development of
barley endosperm. In: The Biology of
Seeds: recent research advances. G. Nicolas, K.J. Bradford, D. Côme and
H.W. Pitchard,, eds. CABI Publishing. pp 77-84.
-
Martinez M.,
Lopez-Solanilla, E., Rodríguez-Palenzuela, P., Carbonero P., Diaz, I. (2003). Inhibition of plant
pathogenic fungi by the barley cystatin Hv-CPI (Icy gene) is not associated with its cysteine-proteinase inhibitory
properties. Molecular Plant-Microbe
Interactions 16: 876-883.
-
Lijavetzky, D.,
Carbonero P., Vicente-Carbajosa, J. (2003). Genome wide comparative
phylogenetic analysis of the rice and Arabidopsis Dof gene families. BMC Evolutionary Biology 3: 17.
-
Carbonero P.,
Rubio-Somoza, I., Martínez, M., Diaz, I. (2004). Factores transcripcionales de
las familias R2R3MYB, R1MYB y DOF actúan como reguladores de la expresión de
genes inducibles por GA durante la germinación de la semilla de cebada. En:
Metabolismo y modo de acción de fitohormonas. Rodríguez Martín, M.D. y
Nicolás-Rodríguez, C., eds. Aguilafuente Ediciones Universidad de Salamanca,
pp. 123-133.
-
Martinez M.,
Rubio-Somoza, I., Fuentes, R., Lara, P., Carbonero P., Diaz, I. (2005). The barley cystatin
gene (Icy) is regulated by DOF transcription factors in aleurone cells upon
germination. Journal of Experimental Botany 56: 547-556.
-
Díaz, I.,
Martinez M., Isabel-LaMoneda, I.,
Rubio-Somoza, I., Carbonero P. (2005). The DOF protein SAD interacts
with GAMYB in plant nuclei and activates transcription of endosperm-specific
genes during barley seed development. The Plant Journal 42: 652-662.
-
Martinez, M.,
Abraham, Z., Gambardella, M., Echaide,
M., Carbonero, P., Diaz, I. (2005). The strawberry gene Cyf1 encodes a phytocystatin with antifungal properties. Journal of
Experimental Botany 56: 1821-1829.
-
Martinez, M., Abraham, Z., Carbonero, P. and Diaz, I.
(2005). Comparative
phylogenetic analysis of barley, rice and Arabidopsis cystatin gene families.
Molecular Genetics and Genomics 273:423-432.
-
Vicente-Carbajosa,
J., Carbonero, P. (2005). Seed maturation: developing and intrusive phase to
accomplish a quiescent state. International Journal Developmental Biology 49:
645-651.
-
Carbonero, P.,
Diaz, I. (2005). Ingeniería genética y agricultura contemporánea. Phytoma
España 169: 40-46.
-
Rubio-Somoza, I.,
Martinez, M., Diaz, I., Carbonero, P. (2006). HvMCB1, a R1MYB transcription
factor from barley, with antagonistic regulatory functions during seed
development and germination. The Plant Journal 45: 17-30.
-
Rubio-Somoza, I.,
Martinez, M., Abraham, Z., Diaz, I., Carbonero, P. (2006). Ternary complex
formation between HvMYBS3 and other factors involved in transcriptional control
in barley seeds. The Plant Journal 47: 269-281.
-
Martinez, M.,
Alvarez-Alfageme, F., Castañera, P., Carbonero, P., Diaz, I. (2006). Barley cystatin
variants against phytopatyhogenic fungi, pests and their impact n natural
enemies. IOBC-WPRS Bulletin 29(5): 91-96.
-
Abraham, Z.,
Martinez, M., Carbonero, P., Diaz, I. (2006). Structural and functional
diversity within the cystatin gene family of Hordeum vulgare. Journal of Experimental Botany 57:
4245-4255.
-
Weltmeier, F., Ehlert, A., Mayer, C.S., Dietrich, K.,
Wang, X., Schütze, K., Alonso, R., Harter, K., Vicente-Carbajosa, J.,
Dröge-Laser, W. (2006). Combinatorial control of Arabidopsis proline dehydrogenase transcription by specific
heterodimerisation of bZIP transcription factors. The EMBO Journal 25:
3133-3143.
-
Ehlert, A., Weltmeier, F., Wang, X., Mayer, C.S.,
Smeekens, S., Vicente-Carbajosa, J., Dröge-Laser, W. (2006). Two-hybrid
protein-protein interaction analysis in Arabidopsis protoplasts: establishment
of a heterodimerization map of group C and group S bZIP transcription factors.
The Plant Journal 46: 890-900.
-
Weiste, C., Iven, T., Fischer, U., Oñate-Sanchez, L.,
Dröge-Laser, W. (2007). In planta
ORFeome analysis by large-scale over-expression of GATEWAY®- compatible cDNA
clones: screening of ERF transcription factors involved in abiotic stress
defense. The Plant Journal 52: 382-390.
-
Moreno-Risueño,
M.A., Martinez, M., Vicente-Carbajosa, J., Carbonero, P. (2007). The family of DOF
transcription factors: from green unicellular algae to vascular plants.
Molecular Genetics and Genomics 277: 379-390.
-
Moreno-Risueño,
M.A., Diaz, I., Carrillo, L., Fuentes, R., Carbonero, P. (2007). The HvDOF19
transcription factor mediates the abscisic acid-dependent repression of
hydrolase genes in germinating barley aleurone. The Plant Journal 51:
352-365.
-
Oñate-Sanchez, L.,
-
Moreno-Risueño, M.A., González, N., Diaz,