Bases moleculares de la alergenicidad y reactividad cruzada de alimentos de origen vegetal.

Investigadora Principal : Araceli Díaz Perales, Profesora Contratada Doctor

Personal :

Gabriel Salcedo, Catedrático de Universidad

Rosa Sánchez Monge, Profesora Titular de Universidad

Arantxa Palacin Gómez, Contratada Posdoctoral

Leticia Tordesillas, Contratada Predoctoral

Cristina Gómez Casado, Estudiante Predoctoral

Líneas de investigación :

- Bases moleculares de la alergenicidad y reactividad cruzada en alimentos vegetales

o Identificación de epítopos B y T de alergenos de origen vegetal

o Caracterización de la interacción alergeno/células del sistema inmune, mediante modelos celulares in vitro

- Mejora del diagnóstico y tratamiento de las alergias de origen vegetal

o Identificación y purificación de proteínas responsables de alergia a alimentos vegetales y a pólenes

o Diseño de algoritmos diagnósticos con alergenos purificados (baterías para prueba cutánea, micromatrices de proteínas)

o Producción de vacunas personalizadas (con alergenos puros, naturales o recombinantes o con formas hipoalergénicas) para su uso en tratamientos de inmunoterapia

Desarrollo :

Las alergias alimentarias se han incrementado en la última década, y, actualmente, se estima que afectan entre un 2-8% de la población, con una especial incidencia de los alimentos de origen vegetal en pacientes adultos. Sin embargo, los métodos de diagnóstico y tratamiento (potencial inmunoterapia), así como el conocimiento de los mecanismos de sensibilización, desarrollo de síntomas clínicos y reacciones cruzadas a distintas fuentes alergénicas (varios alimentos y/o pólenes), son en general, inadecuados e incompletos. Aunque la caracterización de los alergenos más relevantes ha permitido mejorar el manejo clínico y ha contribuido a esclarecer los mecanismos básicos de las reacciones alérgicas, parece justificado aspirar, como etapa posterior, a la disección molecular de estos alergenos, para establecer las bases estructurales de su alergenicidad y reactividad cruzada.

En el grupo, hay especial interés en el estudio de las bases moleculares de la alergia, centrándose en alergias alimentaria de origen vegetal, como punto de inicio para el desarrollo de nuevos métodos diagnósticos, tratamiento y de detección de contaminación alergénica. Para ello, se están desarrollando distintas estrategias de aproximación:

- La identificación de epítopos B de alergenos y el estudio de su implicación en reacciones cruzadas entre con alergenos homólogos de otros alimentos y pólenes.

- Análisis del papel de los N-oligosacáridos complejos en la capacidad alergénica y en reactividades cruzadas.

- Estudio de la interacción entre alergeno y el sistema inmunitario y el epitelio intestinal.

- Producción de nuevos métodos diagnóstico mediante la generación de micromatrices de alergenos

- Diseño de nuevas estrategias de tratamiento de alergias a través de la producción de formas hipoalergénicas.

En los últimos años, el grupo ha desarrollado estas estrategias centrándose en el estudio de tres familias de proteínas que han servido como modelo de estudio: dos de las familias de panalergenos alimentarios más significativos en la población adulta española –proteínas de transferencia de lípidos (LTPs) y profilinas- , y una tercera familia –taumatinas- con una relevancia clínica creciente.

1. Bases moleculares de la unión a IgE (epítopos B) y de la activación de células T (epítopos T)

Las alergias vienen definidas como una reacción de hipersensibilidad en la que resulta la producción de IgE específica frente al alergeno. Por ello, se tiene un gran interés en localizar los epítopos B de los alergenos que están implicados en la interacción con dicha inmunoglobulina, como primera aproximación para la producción de formas hipoalergénicas. La caracterización de epítopos B se puede llevar a cabo mediante: i) el análisis de la unión de IgE a péptidos solapantes unidos a membranas; ii) identificación de mimótopos por ‘phage display’; iii) mutagénesis dirigidas. Todos los trabajos realizados en este sentido han sido fruto de la colaboración con el Dr Luis Fernández Pacios de ETSI de Montes (UPM).

a) Epítopos B de Pru p 3

Dentro de este objetivo , se han identificado los epítopos B de Pru p 3, como modelo de proteína de transferencia de lípidos y alergeno principal del melocotón. De esta forma, se han acotado dos regiones adyacentes en la superficie de Pru p 3: N₃₅N₃₆L₃₇R₃₉T₄₀P₄₂D₄₃R₄₄A₄₆ // P₇₀S₇₆I₇₇P₇₈Y₇₉. La confirmación de la importancia de estos residuos en la alergenicidad de Pru p 3 ha de realizarse mediante mutagénesis dirigida.

b) Bases moleculares de la reactividad cruzada entre LTPs: Pru p 3 y Tri a 14 como modelos de sensibilización por ingestión e inhalación

Mediante la técnica de ‘phage display’, se seleccionaron clones con IgE específica a Pru p 3 y Tri a 14, alergeno mayor y LTP de trigo. Cuando se analizaron las inserciones de los clones eluidos, se encontró una elevada correlación de residuos en ambas proteínas, presentando regiones en superficie similares (Figura 1): L₃₄H₃₅N₃₆R₃₉S₄₀S₄₂D₄₃G₇₄V₇₅L₇₇P₇₈Y₇₉T₈₀. Esto puso de manifiesto que era posible que no existan epítopos específicos para cada alergeno, y que las diferencias de sensibilización sean debidas a diferencias en los potenciales de membrana u otros motivos que no conocemos por el momento.

c) Epítopos B de Cuc m 2, alergeno mayor y profilina de melón.

Empleando una combinación de péptidos solapantes y reconocidos por ‘phage display’ con IgE específica a Cuc m 2 de suero de pacientes con alergia a melón, se identificó un epítopo B mayoritario: S₂W₃A₅Y₆D₉H₁₀T₁₁₁P₁₁₂G₁₁₃Q₁₁₄N₁₁₆M₁₁₇R₁₂₁L_122.

Estos residuos fueron localizados en la superficie de la estructura tridimensional de Cuc m 2, así como en la de otras profilinas alergénicas con relevancia clínica (Phl p 12, polen de Phleum pratensis; Bet v 2, polen de Betula verrucosa) o en la de la profilina humana PLP1. Es de destacar que los residuos implicados en la unión a IgE de Cuc m 2 estaban muy conservados en las otras profilinas con capacidad alergénica, pero no así en la profilina humana.

Estos resultados han sido confirmados mediante el análisis de las propiedades alergénicas de dos mutantes que tienen modificados parte de los residuos del epítopo B por alaninas: Mut 1 (W₃A₅Y₆L₁₂₂) y Mut 2 (S₂D₉H₁₀T₁₁₁P₁₁₂G₁₁₃Q₁₁₄N₁₁₆M₁₁₇R₁₂₁). De esta forma, se pudo comprobar que el mutante 2 tiene fuertemente reducida su capacidad de uniónunir a IgE (Figura 2), así como de su alergenicidad en prueba cutánea. Sin embargo, su capacidad de inducir la proliferación de linfocitos T (los epítopos T) se mantiene al mismo nivel en las tres formas.

d) Epítopos T de Pru p 3

Mediante el cultivo de células mononucleadas de sangre periférica (PBMCs) procedentes de pacientes con alergia a melocotón, y controles no sensibilizados, en presencia de Pru p 3 o péptidos derivados del alergeno, se pudo localizar una región con importancia en el reconocimiento de Pru p 3 por células T: el epítopo Pru p 3 _65-80. Por otra parte, el análisis de patrón de citoquinas por ELISA evidenciaron que el patrón que presentaban los pacientes alérgicos estaban asociadas con un tipo de respuesta Th2 o relacionada con alergia, frente a la respuesta Th1, o respueta frente a bacterias, que presentaban los sujetos controles.

2. Análisis de la relevancia y papel en reacciones cruzada entre alimentos y/o pólenes de LTPs y taumatina.

Para analizar los perfiles de sensibilización a miembros de ambas familias, se han purificado 14 proteínas de cada familia y se han impreso en una micromatriz. Este array, va a ser hibridado por sueros de pacientes procedentes de distintas regiones españolas (con diferente perfil polínico) y establecer patrones de reconocimiento. De igual modo, esta micromatriz es un prototipo para poder ser empleado en el diagnóstico de alergias (CDR, Component Diagnosis Resolved) (Figura 3).

Publications

Palacin A, Quirce S, Sanchez-Monge R, Bobolea I, Diaz-Perales A, Martin-Muñoz F, Pascual C, Salcedo G (2011). Sensitization profiles to purified plant food allergens among pediatric patients with allergy to banana. Pediatr Allergy Immunol; 22:186-9

Palacin A, Bartra J, Muñoz R, Díaz-Perales A, Valero A, Salcedo G. (2010) Anaphylaxis to Wheat Flour-Derived Foodstuffs and the Lipid Transfer Protein Syndrome: A Potential Role of Wheat Lipid Transfer Protein Tri a 14. Int Arch Allergy Immunol; 152:178-183.

Tordesillas L, Pacios LF, Palacín A, Cuesta-Herranz J, Madero M, Díaz-Perales A (2010): Characterization of IgE-epitopes of Cuc m 2, the major melon allergen, and their role in cross-reactivity with pollen profilins. Clin Exp Allergy, 40:174-181

Palacín A, Tordesillas L, Gamboa P, Sanchez-Monge R, Cuesta-Herranz J, Sanz ML, Barber D, Salcedo G, Díaz-Perales A (2010): Characterization of peach thaumatin–like proteins and their identification as major peach allergens. Clin Exp allergy, 40:1422-1430.

Tordesillas L, Cuesta-Herranz J, Gonzalez-Muñoz M, Pacios LF, Compés E, Garcia-Carrasco B, Sanchez-Monge R, Salcedo G and Díaz-Perales A (2009): T-epitopes of the major peach allergen, Pru p 3: identification and differential T-cell response of allergic patients and controls. Mol immunol, 46:722-8.

de Gregorio M, Armentia A, Díaz-Perales A, Palacín A, Dueñas-Laita A, Martín B, Salcedo G, Sánchez-Monge R (2009): Salt-Soluble proteins from wheat-derived foodstuffs show lower allergenic potency than those from raw flour. J Agric Food Chem, 57: 3325-30.

Palacin A, Varela J, Quirce S, del Pozo V, Tordesillas L, Barranco P, Fernandez-Nieto M, Sastre J, Diaz-Perales A, Salcedo G (2009): Recombiant lipid transfer protein Tri a 14: a novel heat and proteolitic resistant tool for the diagnosis of Baker’s asthma. Clin Exp Allergy, 39: 1267-76.

Armentia A, Díaz-Perales A, Castrodeza J, Dueñas-Laita A, Palacin A, Fernández S (2009). Why can patients with baker's asthma tolerate wheat flour ingestion? Is wheat pollen allergy relevant?. Allergol Immunopathol, 37: 203-4.

Tordesillas L, Pacios LF, Palacin A, Quirce S, Armentia A, Barber D, Salcedo G, Diaz-Perales A. (2009): Molecular basis of allergen cross-reactivity: Non-specific lipid transfer proteins from wheat flour and peach fruit as models. Mol Immunol. 47: 534-540.

Pacios LF, Tordesillas L, Cuesta-Herranz J, Compes E, Sánchez-Monge R, Palacín A, Salcedo G and Díaz-Perales A (2008). Mimotope mapping as a complementary strategy to define allergen IgE-epitopes: peach Pru p 3 allergen as a model. Mol Immunol, 45: 2269-76.

Palacin A, Quirce S, Armentia A, Díaz-Perales A and Salcedo G (2008). Airborne allergy to wheat lipid transfer protein without food allergy?. Reply. J Allergy Clin Immunol, 121: 1292-3.

Figura 1. Estructura 3D de Pru p 3 (panel superior) y Tri a 14 (panel inferior) donde se ha destacado los residuos implicados en unión a IgE (lazo rosa y azul). A. Diagrama de lazos; B, Superficie electrostática de los residuos implicados; C, Superficie electrostática.

Figura 2 : Caracterización alergénica de los mutantes de Cuc m 2. Panel superior, separación SDS-PAGE, con tinción Coomassie o réplicas electrotransferidas e incubadas con sueros o anticuerpos específicos. Panel central, cuantificación de la unión a IgE mediante ensayos tipo ELISA. Panel inferior, comparación de la producción de citoquinas de células T de pacientes sensibilizados a Cuc m 2 cultivadas con el alergeno o con sus mutantes.

Figura 3 : Ejemplo de resultado de hibridar una matriz de alergenos con 400 sueros y su posterior análisis por grupos