Interacciones simbióticas planta-microorganismo
Responsable del grupo: Tomas Ruiz Argüeso
Personal:
Nuestro trabajo está enfocado en el estudio de la genetica, fisiología y bioquímica de diversos caraceres implicados en el establecimiento y funcionalidad de las asociaciones simbióticas Rhizobium-leguminosa. En este momento se desarrollan dos líneas principales:
Biología molecular de hidrogenasas de Rhizobium.
Las hidrogenasas de bacteria diazotróficas contienen Ni y Fe en su centro activo. Estos enzimas oxidan el hidrógeno generado por la nitrogenasa durante el proceso de fijación de nitrogeno. Nuestro interés se centra en la descripción del proceso de biosíntesis de las hidrogenasas FeNi y en el desarrollo del potencial biotecnológico del reciclado de hidrógeno para la mejora de la fiación de nitrogeno por leguminosas. El sistema de oxidación de hidrógeno (sistema Hup) de Rhizobium leguminosarum ha sido modificado para posibilitar la transferencia de la capacidad de reciclado de hidrógeno a otras cepas con el propósito último de generar cepas de inoculantes rizobianos con un mayor valor agrícola y bajo impacto ambiental. Asimismo, estamos caracterizando diversos factores que afectan la expresión de la capacidad de reciclado de hidrógeno. Estos factores incluyen el nivel de níquel, la actividad de los promotores de los genes de la hidrogenasa, y el efecto de la leguminosa hospedadora.
El análisis de la exportación de la hidrogenasa a la cara periplásmica de la membrana ha permitido apreciar la relevancia del sistema Tat (Twin arginine translocation), un sistema de transporte que media la exportación de proteínas en conformación plegada. Este sistema es esencial para la exportación de la hidrogenasa, pero también para el establecimiento de la propia simbiosis. Estamos interesados en identificar las proteínas de relevancia simbiótica que forman parte del secretoma Tat.
Análisis de funciones implicadas en la adaptación a condiciones de suelo y rizosfera.
Estamos interesados en tres tipos de caracteres y condiciones relevantes para la adaptación de las bacterias al hábitat rizosférico:
i) Microaerobiosis. Las bajas tensiones de oxígeno son frecuentes en hábitats naturales como el suelo, particularmente en la rizosfera, donde la mayor disponibilidad de compuestos carbonados aportadas por los exudados radiculares incrementa la tasa de actividad microbiana. Hemos identificado en R. leguminosarum un alto número de genes regulados por condiciones micro-óxicas en lo que constituye el “estimulón microaeróbico”. Este conjunto de genes codifica funciones respiratorias, metabólicas y de respuesta a stress que son requeridas para el funcionamiento óptimo de la simbiosis y para la supervivencia de la bacteria en la rizosfera.
ii) Disponibilidad de hierro. La obtención de hierro supone una serie de retos para las bacterias del suelo: es un elemento esencial, muy insoluble en su forma férrica normal, y es al mismo tiempo citotóxico a altos niveles, debido a la generación de radicales libres. Por otro lado, es un elemento clave para la síntesis de proteínas de elevada relevancia simbiótica, como la nitrogenasa, que contienen hierro.
iii) Quorum sensing. Las bacterias son capaces de detectar la densidad celular y responder a la misma modificando el patrón de expresión génica a través de la acumulación de señales químicas (autoinductores). En el caso de las bacterias Gram-negativas, estas señales son fundamentalmente de tipo acil-homoserina lactonas (AHLs). La capacidad de ofrecer una respuesta coordinada a la presencia de otras bacterias en el medio es un aspecto clave de la adaptación de las bacterias
La mejor comprensión de la adaptación bacteriana a las condiciones microaeróbicas, la baja disponibilidad de hierro y a las señales de “quorum sensing” debería permitirnos diseñar estrategias moleculares útiles para la generación de inoculantes rizobianos más competitivos.
Resultados más relevantes
Biología molecular de hidrogenasas de Rhizobium
Biosíntesis de la hidrogenasa. La mayor parte de los datos disponibles sobre el proceso de biosíntesis de la hidrogenasa FeNi se refieren a la síntesis y ensamblaje del centro activo heterómetálico del enzima. Nuestro grupo ha contribuido a la descripción de la función de algunso de los productos génicos implicados en la incorporación del centro activo metálico a la subunidad mayor del enzima (Palacios et al., 2005). Asimismo, hemos demostrado que un grupo de proteínas Hup (HupGHIJ) está implicado en la biosíntesis de la subunidad menor del enzima (HupS) (Manyani et al., 2005). HupS contiene los grupos Fe/S clusters que proporcionan el camino de salida a los electrones del hidrógeno. Habíamos mostrado previamente que una de estas proteínas (HupI) es una rubredoxina que podría estar implicad en la incorporación de los clusters metálicos. El efecto de mutaciones en estos genes es más drástico cuanto mayor es el nivel de oxígeno (Manyani et al., 2005), lo cual sugiere una posible relación de estas proteínas con el metabolismo de Fe para la biosíntesis de la hidrogenasa.
La síntesis de la hidrogenasa depende de la provisión de niveles adecuados de níquel. Hemos podido demostrar que la disponibilidad de níquel del suelo es un factor limitante para la biosíntesis del enzima y que dicha limitación se ejerce al nivel del procesamiento de las proteínas estructurales del enzima (Ureta et al., 2005).
La leguminosa hospedadora juega un papel relevante en la expresión del sistema hup, y se han descrito huéspedes permisivos (guisante) y no permisivos (lenteja) para la inducción de actividad hidrogenasa. RRecientemente hemos podido demostrar que este condicionamento por parte de la planta modula la expresión del sistema hup a undoble nivel transcripcional y post-transcripcional (Brito et al., 2008)
Un aspecto importante de la biosíntesis de la hidrogenasa es la regulación de la expresión génica. Habíamos descrito con anterioridad que el promotor principal que controla la expresión de los genes estructurales del enzima está controlado por NifA, el principal activador de los genes de fijación de nitrógeno. Recientemente hemos analizado la estructura de este promotor y demostrado que posee una organización distinta de las secuencias de unión a l activador que le proporcionan unas características únicas (Martínez et al., 2008). Asimismo, hemos demostrado la existencia de un promotor interno, tambien dependiente de NifA, que controla la trascripción de los genes hupGHIJ y hemos estudiado la autorregulación del propio regulador NifA (Martinez et al., 2004b).
Biotecnología de la hidrogenasa. Desde un punto de vista aplicado, la relevancia del sistema de reciclado de hidrógeno para la productividad del sistema de Vignasido demostrada recientemente en el laboratorio para el caso (Baginsky et al, 2004). Datos más recientes indican que cepas de vezaViia sativa modificados genéticamente ara expresar el sistema hupfijan significativamente más nitrógeno (Ureta et al., manuscrito en preparación). Hemos analizado también la biodiversidad de los sistemas hidrogenasa presentes en Rhizobiaceae (Baginsky et al, 2004; Brito et al., 2005; Fernandez et al., 2005). Mediante este análisis hemos podido demostrar que las agrupaciones hup están extremadamente conservadas en cepas de R. leguminosarum, y presentan algunos componentes específicos. Por otro lado, la diversidad de genes reguladores y secuencias de promotores indican la existencia de diferencias notables en la regulación de la expresión en diversos sistemas. Estos datos ayudarán a construir vehículos génicos más eficientes para extender la capacidad de reciclado de hidrógeno a otras bacterias.
Bases moleculares de la adaptación de Rhizobium leguminosarum a la rizosfera.
Es de esperar que existan múltiples factores que afecten la adaptación de esta bacteria a las condiciones de la rizosfera. Con el fin de abrir una vía para proceder al análisis de estos factores hemos realizado esfuerzos considerables para la determinación de la secuencia gnómica de R. leguminosarum UPM791. La disponibilidad de esta base de datos nos está facilitando la identificación de genes expresado en condiciones microaeróbicas, así como de genes relacionados con la incorporación de hierro.
La comunicación intercelular via “quórum sensing” es un componente clave de la adaptación de la bacteria a las condiciones hostiles de la rizosfera. Hemos demostrado que R. leguminosarum UPM791 produce tres tipos mayoritarios de AHLs. Un aproximación basada en la eliminación de estas señales mediante la expresión de una lactonasa (“quorum quenching”), en combinación con técnicas proteómicas, nos ha permitido identificar las proteínas más rlevntes inducidas en respuesta a la alta densidad celular (Cantero et al, 2006).
References
Baginsky, C., et al. (2004) FEMS Microbiol Lett 237, 399-405
Baginsky, C., et al. (2005) Appl Environ Microbiol 71, 7536-7538
Brito, B., et al. (2005) Biochem Soc Trans 33, 33-35
Brito et al. (2008) Mol. Plant Microbe Interact
Cantero, L., et al. (2006) Proteomics 6 Suppl 1, S97-S106
Fernandez, D., et al. (2005) FEMS Microbiol Lett 253, 83-88
Manyani, H., et al. (2005) J Bacteriol 187, 7018-7026
Martinez, M., et al. (2004) J Bacteriol 186, 6586-6594
Martinez, M., et al. (2004)
Microbiology 150, 665-675
Martínez, M., etal. (2008) J. Bacteriol in press
Palacios, J. M., et al. (2005) Biochem Soc Trans 33, 94-96
Ureta, A. C., et al. (2005) Appl Environ Microbiol 71, 7603-7606