PROYECTO AL11-PID-09

Estudio comparativo de bacterias endosimbióticas fijadoras de nitrógeno aisladas de Phaseolus lunatus y de Lupinus mariae-josephi

PARTICIPANTES:

Universidad Politécnica de Madrid, España

Responsable:         Luis Rey Navarro                Profesor Titular de Universidad

Participantes:         Tomás Ruiz-Argüeso         Catedrático de Universidad
                                David   Duran Wendt         Becario predoctoral

Dirección
Universidad Politécnica de Madrid
Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas
Campus de Montegancedo
Autovía M-40, Km 38
28223 Pozuelo de Alarcón (Madrid)

Teléfono:       34-91-3364570
Fax:              34-91-7157721
Contacto:      luis.rey@upm.es

Centro de Ciencias Genómicas. Universidad Autónoma Nacional de México, Cuernavaca, México

Responsable: Esperanza Martínez Romero                Investigador Titular
Participantes: Ernesto Ormeño Orrillo                       Investigador postdoctoral

Dirección
Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, Apdo. Postal 565-A, Cuernavaca, Morelos, México

Teléfono:      527773131697
Fax:             527773175581
Contacto:     emartine@ccg.unam.mx

OBJETIVOS DEL PROYECTO

El propósito de este proyecto es caracterizar genómica y fenotípicamente aislamientos tipo de las colecciones de rizobios aislados de Phaseolus lunatus en Perú y de Lupinus mariae-josephi en España como vía para extender el cultivo de P. lunatus y asegurar la supervivencia de L. mariae-josephi.
Estos rizobios exhiben un crecimiento extraordinariamente lento y muestran entre ellos un alto grado de conservación respecto al gen 16S rRNA (Sánchez-Cañizares, 2011).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Objetivo 1. Análisis genético y filogenético comparativo de bacterias endosimbióticas de crecimiento extralento aisladas de P. lunatus y de L. mariae-josephi.
En estudios previos se han realizado árboles filogenéticos con las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, dnaK, nifH y nodB de los aislados de P. lunatus y de los genes 16S rRNA, recA, glnII, atpD y nodC de los aislados de L. mariae-josephi. Para establecer un análisis más robusto entre estos aislados se secuenciarán los genes recA, glnII, atpD y nodC de los aislados de P. lunatus y los genes dnaK, nifH y nodB de los aislados de L. mariae-josephi. Con las nuevas secuencias se construirán arboles filogenéticos multilocus. Adicionalmente, se realizarán inoculaciones cruzadas y otras pruebas fenotípicas entre las que se encuentra la evaluación de su crecimiento en medios con diferentes nutrientes.
Objetivo 2. Caracterización de las bacterias endosimbióticas por MALDI-TOF.
En un género con especies muy diversas como Bradyrhizobium la utilización de la técnica de espectrometría de masas MALDI-TOF con células enteras (ICM-MS) puede ser de gran utilidad para poner de manifiesto semejanzas y diferencias entre las diferentes especies y/o cepas en base a la relación masa/carga (m/z) principalmente de moléculas de la superficie celular. Este análisis incluirá otros rizobios de referencia. Esta técnica ya se ha mostrado útil en la taxonomía molecular de bacterias endosimbióticas de leguminosas (Prabhu et al, 2007).
Objetivo 3. Secuenciación masiva de aislamientos tipo de L. mariae-josephi y de P. lunatus.
La secuenciación de una parte significativa del genoma de estas bacterias permitirá obtener información relevante sobre funciones y actividades que pueden realizar estas bacterias y que explican su forma de vida y su adaptación a diferentes condiciones ambientales. Un análisis comparativo de los genomas que se obtengan con la de otros bradyrhizobia cuyo genoma está disponible en bases de datos servirá para identificar genes conservados entre ellos y los que comparten sólo algunos y los que son exclusivos. Se estudiarán en detalle los que son esenciales y/o relevantes para la simbiosis como los implicados en movilidad, producción de exopolisacáridos y lipopolisacáridos, sistemas de secreción, producción de factores de nodulación y genes implicados en la fijación biológica de nitrógeno, entre otros.
Objetivo 4. Generación de mutantes
La obtención de mutantes es una herramienta útil para conocer la función de un gen. En estas cepas de crecimiento extraordinariamente lento no se ha generado ningún mutante hasta el momento por lo que en el proyecto nos proponemos utilizar métodos aplicados a otros rizobios para generar mutantes. Estos métodos estarían basados en el uso del vector pK18mobSac (Schäfer et al, 1994). En caso de obtener mutantes se valorará su fenotipo en diferentes condiciones tanto de vida libre como simbióticas.

Referencias
- Prabhu, R. R. M. J. Kulkarni, V. A. Parasharami, B. Santhakumari and S. Paranjape. (2007). An attempt at taxonomical characterization of some Rhizobial species by intact cell MALDI mass spectrometry. World Journal of Microbiology and Biotechnology 23:177-185
- Sánchez-Cañizares, C., Rey, L., Durán, D., Temprano, F., Sánchez-Jiménez, P., Navarro, A., Polajnar, M., Imperial, J., Ruiz-Argueso, T (2011). Endosymbiotic bacteria nodulating Lupinus mariaejosephi, a new lupine endemic of alkaline soils in Eastern Spain, represent a new lineage within Bradyrhizobium genus. Systematic and Applied Microbiology, en prensa.
- Schäfer, A., Tauch, A., Jager, W., Kalinowski, J., Thierbach, G., and Puhler, A. (1994) Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutaminicum. Gene 145: 69-63.

     Figura 1. Lupinus mariae-josephi. Detalle de hojas, flores, frutos y semillas 

     Figura 2. Estrategia de aislamiento de bacterias endosimbióticas de L. mariae-josephi

     Figura 3. Arból filogenético basado en las secuencias del gen 16S rRNA(Sánchez-Cañizares et al, 2011). El cuadrado rojo incluye todos los aislados de L. mariae-josephi

     (Lmj) y otras bacterias. El verde incluye los aislados de Phaseolus lunatus (LMTR). Ambos tipos de aislados son objeto de estudio en este Proyecto